【技術(shù)標準解析】CDE納米藥物質(zhì)量控制研究技術(shù)指導(dǎo)原則解讀（一）

#本文由馬爾文帕納科應(yīng)用專家張鵬博士供稿#

為規(guī)范和指導(dǎo)納米藥物研究與評價，在國家藥品監(jiān)督管理局的部署下，藥審中心組織制定了《納米藥物質(zhì)量控制研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》、《納米藥物非臨床藥代動力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》《納米藥物非臨床安全性評價研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》三項關(guān)于納米藥物研究、質(zhì)控、評價的技術(shù)指導(dǎo)原則。并由經(jīng)國家藥品監(jiān)督管理局審查同意，8月27日予以發(fā)布通告，三項技術(shù)指導(dǎo)原則自發(fā)布之日起開始施行。

其中《納米藥物質(zhì)量控制研究技術(shù)指導(dǎo)原則》主要內(nèi)容是圍繞著納米藥物的安全性、有效性以及質(zhì)量可控性展開的。在這3方面，質(zhì)量的可控性顯得尤為重要，它一定程度上決定了藥物的安全性和有效性。

該指導(dǎo)原則進一步將納米藥物細分為三類：藥物納米粒、載體類納米藥物以及其他類納米藥物，前兩類藥物適用于該指導(dǎo)原則。

在研發(fā)過程中，納米藥物的質(zhì)量控制指標又可以分為納米相關(guān)特性和制劑基本特性兩大類。其中納米相關(guān)特性是可能與藥物在體內(nèi)行為息息相關(guān)的重要質(zhì)量指標。又包括例如平均粒徑及其分布、納米粒結(jié)構(gòu)特征、微觀形態(tài)、表面性質(zhì)（電荷、比表面積等）包封率、載藥量、納米粒濃度、納米粒穩(wěn)定性等等。

質(zhì)量控制指標涉及方面較多，本文重點關(guān)注以下三個方面的指標：

1. 粒徑（平均粒徑及其分布）

2. 表面電荷

3. 納米粒濃度

在粒徑表征方面，該指導(dǎo)意見原文如下：

“應(yīng)選擇適當?shù)臏y定方法對納米藥物的粒徑及分布進行研究，并進行完整的方法學(xué)驗證及優(yōu)化。粒徑及分布通常采用動態(tài)光散射法（Dynamic light scattering，DLS）進行測定，需要使用經(jīng)過認證的標準物質(zhì)（Certified reference material，CRM）進行校驗，測定結(jié)果為流體動力學(xué)粒徑（Rh），粒徑分布一般采用多分散系數(shù)（Polydispersity index，PDI）表示。除此之外，顯微成像技術(shù)（如透射電鏡（Transmission electron microscopy，TEM）、掃描電鏡（Scanning electron microscopy，SEM）和原子力顯微鏡（Atomic force microscopy，AFM）、納米顆粒跟蹤分析系統(tǒng)(Nanoparticle tracking analysis, NTA)、小角X射線散射（Small-angle X-ray scattering，SAXS）和小角中子散射（Small-angle neutron scattering，SANS）等也可提供納米藥物粒徑大小的信息。對于非單分散的樣品，可考慮將粒徑測定技術(shù)與其它分散/分離技術(shù)聯(lián)用。"

在了解動態(tài)光散射技術(shù)（DLS）之前，我們先來講一講粒徑測量時的“等效球體"的概念。

想象一下，當我們完成顆粒粒徑測試后，該如何用準確的數(shù)值來描述這些三維顆粒的大小呢？當顆粒是規(guī)則的形狀時，比如說正方體、球體，我們可以用一個數(shù)值，例如：邊長、直徑，來表示這個顆粒的大??；但是，當顆粒呈現(xiàn)的形貌是無規(guī)則的話，我們就無法用一個數(shù)值來描述這個顆粒大小了，那有人會說，用一系列數(shù)值來描述這些顆粒不就行了嗎，這個方法確實可行，但是隨之帶來了數(shù)據(jù)呈現(xiàn)的復(fù)雜度以及顆粒粒徑大小比較的困難度。這個時候我們就必須引入“等效球體"概念了。

什么叫做等效球體呢？

當我們通過某種技術(shù)測量顆粒在某一方面的性質(zhì)，并得到了一個具體的數(shù)值，如果一個剛性球體在該性質(zhì)方面的數(shù)值和前者一樣，那么我們就認為待測物的顆粒大小和這個剛性球的大小一致。

等效球體概念在粒徑上的應(yīng)用既能滿足準確表示待測顆粒的粒徑大小，又能使得這些數(shù)值能夠被用來進行大小比較（單個數(shù)值）。

如圖1所示，我們可以得知，當一個不規(guī)則的顆粒采用不同的測量技術(shù)（沉降法、電阻法、體積法等等）去進行測量時，往往會得到不同的粒徑值。

而我們說的動態(tài)光散射技術(shù)測量的是顆粒的擴散速度，所以，具有同樣大小擴散速度的剛性球體的直徑就是待測顆粒的粒徑大小，我們一般稱之為流體力學(xué)直徑。

動態(tài)光散射

接著我們進一步來了解一下什么是DLS技術(shù)：

分散在溶液相的納米顆粒由于受到溶劑分子的撞擊，呈現(xiàn)出無規(guī)則的運動，我們稱之為布朗運動（Brownian motion），如果我們將一束激光照射至含有該納米顆粒的溶液中，溶液相中的顆粒會產(chǎn)生散射光，隨后在一定的角度收集相關(guān)的散射光，我們就能得到如圖2所示的散射光強隨時間的變化曲線，可以看出大顆粒布朗運動較為緩慢，散射光強的變化頻率較慢（圖2，上）。小顆粒則相反，由于其布朗運動劇烈，接收到的散射光強的變化頻率較快（圖2，下）。

而動態(tài)光散射技術(shù)則可以捕獲上述散射光變化的頻率，進而獲得顆粒的布朗運動速率大小，最后通過反演算法獲得顆粒的粒徑和分布。

根據(jù)斯托克斯-愛因斯坦方程（Stokes-Einstein）的定義，我們可以看出，顆粒的運動速率是和它的粒徑成反比的，運動速率越快，粒徑越小，運動速率越慢，粒徑越大。

該方程式：DH=KT/3πηD

K：玻爾茲曼常數(shù)

T：整個體系的絕對溫度值

η：溶劑粘度值

D：顆粒平動擴散系數(shù)

那具體如何獲得顆粒的布朗運動速率(D)呢？

接下來我們要引入“相關(guān)性"這個概念，如圖3所示，如果我們將t時刻的散射光強度和其后較長時間的散射光強相比較，顯然，他們沒有什么相關(guān)性。但是，當我們將時間縮短到很短時間范圍內(nèi)，也就是將t和t+δt時刻的光強值進行比較，就能得到很強的相關(guān)性，隨著時間的增加（δt, 2δt, 3δt, 等等)，其散射光強值和t時刻的相關(guān)性不斷衰減，最后接近0值，相關(guān)性通常用數(shù)值來描述（1→0），數(shù)值越靠近“1"代表相關(guān)性非常高，越接近“0"代表相關(guān)性很低。δt的時間非常短，一般在納秒（nanosecond，ns）或者微秒（microsecond，μs）。

散射光強在不同時間點的相關(guān)性我們用G (τ)來表示：G (τ)=A[1+Bexp (-2Γτ)]

τ代表著信號采集滯后時間

Γ=Dq2，

q=(4πn/λ0) sin(θ/2)，散射矢量

D：顆粒平動擴散系數(shù)

n：溶液的折光指數(shù)

λ0：入射光波長

θ：散射光接收角度

最后，我們用相關(guān)方程來描述這種相關(guān)性隨時間的變化（圖4），大顆粒的散射光強的相關(guān)性隨時間變化慢，信號衰減慢（左），小顆粒的散射光強的相關(guān)性隨時間變化快，信號衰減快（右）。

聊完了DLS的基本原理，我們再來看看大家比較關(guān)注的幾個問題：

1. 什么是Z-average size（平均粒徑）、PI（polydispersity index，多分散指數(shù)）？

Z-average size表示樣品中顆粒的平均粒徑大小，根據(jù)ISO 13321:1996，我們可以知道，該數(shù)據(jù)是通過累計分析法得到的。

PI代表著樣品的粒徑分布寬度，數(shù)值越小，說明體系里的粒徑大小越一致，數(shù)值越大，說明體系里的粒徑分布群體越多，粒徑分布較寬，一般我們認為當PI值大于0.7時，表示這個體系不再適合用DLS這種技術(shù)進行表征了。

除了平均粒徑和PI，我們還能得到顆粒的光強粒徑分布圖，在這個分布圖里，我們能得到不同粒徑下對應(yīng)的散射光強占比數(shù)據(jù)，這些分布圖是根據(jù)分布算法得到的。

2. 如何看待不同測量角度下得到的粒徑數(shù)據(jù)？

市面上主要存在兩種測量角度的納米粒度儀，分別是90°和173°，前者我們稱之為側(cè)向角，后者我們稱之為背向角。

當測試的樣品為粒徑窄分布時，例如聚苯乙烯標準樣品，兩種測量角度都能得到很好的粒徑分布圖，結(jié)果也非常一致（圖5）。

當測試的樣品為粒徑寬分布時，比如一些生物樣品，兩種測量角度得到的粒徑分布圖就會有區(qū)別（見圖6）。

這是為什么呢？

這其實是和顆粒的散射性質(zhì)有關(guān)系的，當顆粒的粒徑大小小于入射波段的1/10時，顆粒在各個方向上的散射光強度都一樣，我們稱之為各向同性，那么在這兩個角度上進行測量，都能得到正確的數(shù)值。但是隨著顆粒粒徑的增加，顆粒在各個方向上的散射光強開始變得不一致，越靠近0度角，其散射光強增加越強烈，我們稱之為各向異性。在絕大多數(shù)情況下，不同粒徑的顆粒其散射強度在90°要比在173°要強一些，當體系中大顆粒開始變多時，來自于大顆粒的散射光強貢獻度在90°角下就會比在173°角下要更多，因為粒徑分布的數(shù)據(jù)是根據(jù)不同粒徑的散射光強在整個體系的占比中得到的，所以在90°角下會使得顆粒的粒徑分布更容易傾向于體系中存在的大顆粒。